Цитология и гистология - Светлана Завалеева

Взятие и фиксирование материала. Максимальные размеры кусочков составляют 1x1x0,5 см; соотношение объема материала и фиксирующей жидкости должно быть не менее 1:9. Взятый из органа образец ткани погружают в фиксатор – простой 70 – 96 %-й спирт, 10 – 12 %-й формалин, растворы уксусной кислоты, бихромата калия, осмиевой кислоты или сложный (смеси простых фиксирующих жидкостей или солей тяжелых металлов в определенных пропорциях, обеспечивающие рН и молярность, близкие к таковым в организме). Действие фиксаторов проявляется в том, что в тканях и органах, в результате сложных биофизических процессов, происходит необратимая коагуляция белков, жизнедеятельность прекращается, то есть клеточные структуры становятся мертвыми. Они теперь находятся в том функциональном состоянии, в котором их застигла смерть, то есть зафиксированными. Фиксация приводит к некоторому уплотнению и уменьшению объема образца.

Уплотнение образцов ткани. Цель этого этапа – достичь высокой плотности и пластичности материала для того, чтобы приготовить из него тонкие срезы. Применяют уплотняющие среды – парафин, целлоидин, желатин, органические смолы или замораживание. Пропитка парафином продолжается от 1 до 4 ч, целлоидином – до 1 – 3 нед. Кусочек ткани предварительно обезвоживают (проводят через спирты возрастающей концентрации); затем спирт вытесняют промежуточной средой, способной смешиваться со спиртом и одновременно растворять уплотняющее вещество. При использовании парафина промежуточной средой служат циклические углеводороды (бензол, ксилол) или хлороформ. Для того, чтобы избежать перепада температур (парафин плавится при 60 °C) после вытеснения спирта ксилолом, образец выдерживают от 2 до 3 ч в смеси парафина с ксилолом при температуре 38 °C. Из уплотненного парафином образца вырезают блоки, из которых и готовят тонкие срезы, способные пропускать свет (что является необходимым условием для световой микроскопии). Наиболее тонкие срезы (толщиной от 5 до 7 мкм) удается изготовить из материала, залитого в парафин. Из образцов, уплотненных целлоидином, готовят срезы толщиной от 10 до 30 мкм. Срезы получают на санных или ротационных микротомах; для экспресс-диагностики (срезы толщиной от 40 до 60 мкм) – на замораживающем микротоме.

Окрашивание срезов. Срезы окрашивают, чтобы увеличить контрастность различных гистологических структур в препаратах, предназначенных для исследования в световом микроскопе. Разработаны разнообразные методы окраски. В процессе окрашивания происходят сложные химические и физические процессы, поэтому при выборе метода учитывают избирательное сродство структур клетки к определенным красителям с разными физико-химическими свойствами.

Все красители подразделяют на кислые, основные и специальные. Структуры срезов, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называют оксифильными, основными красителями – базофильными окрашивающиеся как теми, так и другими – нейтрофильными. Специальные красители селективно выявляют конкретные структуры, обладающие сродством к ним. Наиболее широко распространен комбинированный метод окраски тканей – гематоксилином и эозином. Гематоксилин (основной краситель) окрашивает ядра клеток в синефиолетовый цвет, а эозин (кислый) – элементы цитоплазмы в розово-желтый. Окрашенные препараты обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %), просветляют в ксилоле или некоторых маслах и затем каждый гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или синтетические смолы. Готовый (постоянный) гистологический препарат можно хранить годами и использовать для микроскопирования.

Методы микроскопии. Основным инструментом для изучения гистологического препарата служит микроскоп – световой или электронный.

Световая микроскопия. С помощыо современных световых микроскопов (МБР-1 – микроскоп биологический рабочий, МБИ-1, МБИ-3 или МББИ – микроскоп бинокулярный биологический исследовательский, ЛЮМАМ и других) можно изучать на срезах строение клеток и тканей. Размер наименьшей структуры, которую можно увидеть в световом микроскопе, определяется наименьшим разрешающим расстоянием (d0). У современных микроскопов оно составляет около 0,2 мкм. Приближенно разрешение, или разрешающую способность, можно рассчитать по формуле:

d0=1/3λ, (1)

где λ – длина световой волны.

Для более точного расчета используют формулу, учитывающую конструкцию объектива:

где n – показатель преломления среды между препаратом и фронтальной линзой объектива;

sin α – синус угла между оптической осью и наиболее сильно отклоняющимся лучом, который еще попадает в линзу объектива.

В микроскопических исследованиях используют следующие единицы измерения:

– 1мкм (микрометр)=1×10-3 мм = 1×10-6 м;

– 1 нм (нанометр) = 1×10-3 мкм = 1×10-6 мм = = 1×10-9 м;

– 1 Å (ангстрем) = 0,1 нм = 1×10-4 мкм = 1×10-7 мм = 1×10-10 м.

Из приведенных данных видно, что разрешающая способность световых микроскопов ограничена десятыми долями микрона (микрометра). Структуры клетки меньшего размера можно рассмотреть только с помощью электронного микроскопа. Подробное описание светового и электронного микроскопов дано в соответствующих руководствах и в курсе физики.

Ультрафиолетовая микроскопия – представляет собой разновидность световой. Длина волны ультрафиолетовых лучей составляет около 0,3 мкм; разрешающая способность микроскопа при иммерсионном объективе приблизительно 0,1 мкм.

Люминесцентная микроскопия основана на том, что многие органические вещества, содержащиеся в клетках, способны светиться (флуоресцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции постоянно смещен в сторону более длинных волн по отношению к изучению, возбуждающему флуоресценцию. Этот спектр лежит в пределах коротких волн (длина от 0,25 до 0,4 мкм). Например, хлорофилл зеленых растений в ультрафиолетовых лучах светится красным светом, а другие вещества – зеленым или желтым (то есть с более короткими волнами). Этот принцип использован при создании люминесцентных микроскопов. Источником света в них служат ксеноновые или ртутные лампы (их спектр близок к ультрафиолетовому излучению), а объект исследуют через специальные фильтры.

Собственной, или первичной, флуоресценцией обладают пигменты (в том числе бактерий), витамины А и В2, индоламины и некоторые другие вещества. Существует вторичная, или вызванная, флуоресценция. Чтобы ее получить, используют специальные вещества – флуорохромы, которые связываются различными структурами живой клетки и вызывают их флуоресценцию. Например, при обработке срезов тканей флуорохромом акридиновым оранжевым дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и ее производные приобретают яркозеленое свечение, а рибонуклеиновая кислота (РНК) и ее производные – яркокрасное. Разновидностью вторичной является флюоресценция желто-зеленого цвета, индуцированная парами формальдегида и характерная для катехоламинов (адреналин и норадреналин) мозгового вещества надпочечников. Таким образом, можно исследовать химический состав тканевых структур, выявлять трофические и секреторные включения в клетках.

Электронная микроскопия. В электронном микроскопе используются электронные лучи с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн при напряжениях от 50000 до 100000 В. Длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока или пучка электронов в условиях вакуума равна 0,0056 нм. Таким образом, разрешение достигает 0,002 нм или 0,000002 мкм, что в 100000 раз выше, чем в световом микроскопе. Разрешающая способность современных отечественных электронных микроскопов (ЭМВ-200, 300) и зарубежных (фирм Хитачи, Филипс) составляет не более от 1 до 5 А, однако на практике она не превышает от 0,2 до 0,5 нм, а для большинства биологических объектов от 1 до 2 нм. Методом электронной микроскопии исследуют ультратонкие срезы, толщиной от 500 до 1000 А, которые готовят на ультратомах – сложных электронных приборах, где ножами служат очень острые грани сломов зеркального стекла. Тончайшие срезы наносят на специальные металлические сетки с ячейками и помещают в вакуумную камеру электронного микроскопа. Обработка образцов тканей для ЭМ сходна с ранее описанной обработкой для световой микроскопии. Только здесь в качестве фиксаторов используют забуференные растворы параформа, тетроксида осмия, глютаральдегида (рН 7,0 – 7,4); образцы проводят через спирты восходящей концентрации и пропилен-оксид и заливают в синтетические смолы (аралдит, эпон или в их смесь). Чтобы более четко выявить, органеллы мембранного и немембранного типа в качестве контрастера применяют цитрат свинца и уранилацетат.

К современным электронно-микроскопическим методам относят просвечивающую, или трансмиссионную электронную микроскопию (ПЭМ), сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) электронную авторадиографию, иммунно-электронную микроскопию, ЭМ-гистохимию.