Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века - Максим Франк-Каменецкий

Была сконструирована плазмида, несущая последовательность (ГА)16 •(ТЦ)16. Топоизомеры этой плазмиды были подвергнуты разделению методом двумерного электрофореза. На картинах электрофореза наблюдались характерные разрывы, как в случае крестов и Z-формы. Эти разрывы отсутствовали в контрольных экспериментах с плазмидой, в которую не был встроен участок (ГА)16 •(ТЦ)16. Пятна, отвечающие следующим за разрывом топоизомерам, исчезли из картин двумерного фореза после обработки плазмиды со вставкой однонитевой эндонуклеазой. Эти опыты показали, что под действием отрицательной сверхспирализации в гомопурин-гомопиримидиновой последовательности на самом деле образуется некая альтернативная структура. Но, может быть, образуется одна из уже известных альтернативных структур, крест или Z-форма, просто требования к последовательности на самом деле не столь строги, как принято считать?

Эта возможность полностью исключалась, так как обнаруженный переход оказался очень чувствительным к кислотности среды. При добавлении в среду кислоты переход резко облегчался. Более того, при достаточной кислотности переход наблюдается вообще в релаксированной, несверхспирализованной ДНК! Стало ясно, что речь идет на самом деле о какой-то совершенно новой структуре, поскольку ни одна из известных ранее структур не была столь чувствительной к кислотности среды. Так как эта загадочная структура стабилизировалась кислотой, т. е. ионами водорода, мы назвали ее Н-формой.

У нас в руках были две очень важные количественные характеристики Н-формы. Во-первых, величина скачка при электрофорезе, которая свидетельствовала о том, что в Н-форме комплементарные цепи не закручены друг относительно друга (как и в случае крестов). Во-вторых, зависимость сверхспирализации, при которой происходит переход из В – в Н-форму, от кислотности среды. Теоретический анализ этой зависимости показывал, что в Н-форме на каждые четыре пары оснований вставки (ГА)16 •(ТЦ)16 приходится одно место связывания протона. Нам никак не удавалось придумать структуру, которая бы удовлетворяла этому требованию.

В то время, когда мы ломали головы над этой загадкой, наше внимание привлекла статья А. Р. Моргана и Джероми Ли (Университет Альберты, Канада), опубликованная несколькими годами раньше. Канадские ученые исследовали синтетическую ДНК, комплекс поли (ЦТ) •поли (АГ). Они обнаружили, что в кислой среде пара таких двойных спиралей объединяется в тройной комплекс, состоящий из двух цепей ЦТ и одной цепи АГ. Вторая цепь АГ оказывается «лишней». Тройной комплекс состоит из триад, структура которых приведена на рис. 42. Для нас очень существенно то, что триада ЦГЦ+ образуется путем захвата из среды одного протона. Это и объясняет, почему такая структура образуется, в отсутствие сверхспирального напряжения, только в кислой среде. На основе этих данных мы предположили, что Н-форма имеет структуру, показанную на рис. 43.

Рис. 42. Структура триад ТАТ и ЦГЦ+, из которых строится тройная спираль ДНК. В основе каждой триады лежат обычные уотсон-криковские пары А •Т и Ц •Г (см. рис. 38), к которым присоединяется третье основание. Такой необычный способ присоединения оснований впервые наблюдал в кристаллах К. Хугстин. Для образования хугстиновской пары ГЦ цитозин должен захватить из раствора лишний ион водорода, т. е. протон. Штриховыми линиями показаны водородные связи между основаниями. Как и в случае уотсон-криковских пар, обе триады имеют одинаковые расстояния между атомами азота, связанными с сахаром

Рис. 43. Структура Н-формы ДНК для участка (ГА)16 •(ТЦ)16, встроенного в плазмидную ДНК. Основной элемент структуры – тройная спираль, состоящая из триад, приведенных на рис. 42. Показаны два возможных «изомерных» варианта структуры. Уотсон-криковское спаривание обозначено затемненными кружками, хугстиновское спаривание ГЦ, в котором участвует дополнительный протон, обозначено крестиками

Ясно, что такая структура должна быть очень чувствительна к однонитевой эндонуклеазе, так как половина пуриновой нити вставки находится в однонитевом состоянии.

Мы исследовали также вставки (Г)n •(Ц)n и другие регулярные гомопурин-гомопиримидиновые последовательности. Во всех случаях наблюдалось образование Н-формы.

Так что же, Н-форма может возникнуть в любой гомопурин-гомопиримидиновой последовательности? Нет, согласно модели (рис. 42), гомопурин-гомопиримидинового характера последовательности недостаточно. Требуется еще, чтобы последовательность была зеркальным перевертышем, т. е. чтобы она одинаково читалась справа налево и слева направо по одной и той же цепи (в отличие от обычных перевертышей, образующих кресты, которые одинаково читаются по разным цепям). Понятно, почему все регулярные гомопурин-гомопиримидиновые последовательности образуют Н-форму – ведь они как раз принадлежат к классу зеркальных перевертышей. Легко, однако, придумать нерегулярную последовательность – зеркальный перевертыш, скажем:

Не важно, что центральная последовательность не является гомопурин-гомопиримидиновой, – все равно она окажется в петле в Н-форме (рис. 43). Эксперимент полностью подтвердил наши ожидания, что зеркально-симметричные гомопурин-гомопиримидиновые последовательности переходили в Н-форму, тогда как малейшее нарушение симметрии предотвращало переход. Эти и многие другие опыты доказали правильность предложенной нами структуры Н-формы.

Открытие Н-формы инициировало настоящий бум в изучении тройных спиралей ДНК, начавшийся в середине 1980-х годов и продолжающийся по сегодняшний день.

Мы теперь знаем, что сверхспирализация может вызывать образование в ДНК альтернативных структур трех типов: крестов, Z-формы и Н-формы. Вопрос о биологической роли этих структур находится в стадии интенсивного изучения во многих лабораториях.

10

Генная инженерия и технология редактирования генома. Опасения и надежды

Мы говорим о вступлении в биологический век, и это – не пустые слова. Это явление огромной значимости, один из поворотных пунктов в истории человеческой мысли. Ученые говорят о нуклеопротеинах и ультрацентрифугах, о биохимической генетике, электрофорезе и электронном микроскопе, о строении молекул и радиоактивных изотопах. Не думайте, что все это – не более чем еще одна их забава. Это надежный путь к решению проблем рака и полиомиелита, ревматизма и сердечно-сосудистых заболеваний. На этом пути будут получены знания, на основе которых мы сможем решить проблему обеспечения продовольствием все возрастающее население Земли. Это путь к познанию тайн жизни.

У. Уивер, 1949 г.

Наука и изобретательство

За то время (около 150 тысяч лет), которое существует на планете Земля вид Homo sapiens, с ним не произошло с биологической точки зрения сколько-нибудь значительных изменений. Наши дети рождаются такими же, какими рождались дети наших предков десятки тысяч лет назад. Но насколько изменился мир! Земной шар покрыли сети стальных и асфальтовых дорог, а околоземное пространство исчерчивают невидимыми трассами тысячи самолетов и космических кораблей. Человек побывал на Луне, а сделанные им аппараты посетили Марс, Венеру, прислали на Землю потрясающие снимки Юпитера, Сатурна и их многочисленных спутников, побывали в самых отдаленных уголках Солнечной системы. Часто говорят, что все эти головокружительные успехи человечества – результат развития науки. Это не совсем верно.

Страсть к преобразованию окружающего мира – по-видимому, один из главных инстинктов человека, и проявилась она задолго до возникновения науки. Давным-давно люди стали строить дороги, величественные храмы, пирамиды и другие сооружения, которые и тысячелетия спустя поражают воображение и даже порождают гипотезы о пришельцах из иных миров. Рассказы о пришельцах – это мифы эпохи научно-технической революции, когда люди перестали верить в возможности чистого изобретательства, не основанного на научных знаниях.

Но пирамиды, храмы, парусные и дизельные корабли, паровозы, автомобили и даже самолеты – все это в большей степени результат изобретательства, чем систематического научного исследования. Древо науки стало обильно плодоносить только в XX веке. Но плоды эти оказались такими, что затмили собой все предыдущие достижения человека. В XX веке наука породила две совершенно новые технологии – ядерную технику и электронику, радикально изменившие мир, в котором мы живем. И это произошло на глазах лишь одного поколения.

Подобно тому, как появление транзистора привело к рождению современной электроники, открытие рестриктаз и разработка других методов генной инженерии породили биотехнологию. Как грибы после дождя, возникают биотехнологические компании, создающие на основе совершенно новых технических принципов фармацевтические препараты, вакцины, другие биологически активные вещества. Так что же достигнуто сегодня и над чем будет работать завтра вся эта армия ученых и инженеров?