Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии - Коллектив авторов

Существуют методы получения антител и без использования лабораторных животных. Один из них основан на иммобилизации и включении клеток в твердую матрицу. Второй представляет собой культивирование клеток в гомогенной суспензии. Затруднения в использовании данных технологий возникают в тех случаях, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается обойти толерантность к антигену. Для разрешения этой проблемы предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител.

2.5. Хранение антител

В зависимости от способа очистки и индивидуальных особенностей конкретных антител транспортировка и хранение осуществляются в одной из следующих форм:

1. Лиофилизированные антитела. Перед первым использованием такие антитела необходимо растворить в буфере, состав которого указан производителем, аликвотировать. Как правило, их хранят при –20 °C, не допуская повторного размораживания. Допускается длительная транспортировка, не требующая особых температурных условий.

2. Концентрированный раствор антител. Обычно это 10 мМ фосфатный буфер (рН 7,2 – 7,4) или 10 мМ HEPES (pH 7,4 – 7,5). В буфер добавляют инертный белок, например 1,0 % бычий сывороточный альбумин (BSA), который конкурирует с антителами за места неспецифического связывания на стенках посуды. В качестве криопротектора, защищающего антитела от разрушения при замораживании, используют глицерин (до 50,0 % по массе). В целях предотвращения грибкового и бактериального заражения раствора антител обычно применяют 0,1 % азид натрия. Необходимо обратить внимание на то, что последний является ингибитором пероксидазы! Подбирая антитела, следует тщательно анализировать состав буфера для их хранения. Так, азид натрия можно заменить тимерозалом (до 0,02 %). Иногда в раствор добавляют меркаптоэтанол (до 0,10 %), что необходимо для предотвращения образования дисульфидных связей между субъединицами антител. Перед первым использованием такие антитела также необходимо аликвотировать и хранить при –20 °C (или –70 °C), не допуская повторного размораживания (Boenisch T., 2001).

3. Раствор антител, готовый к употреблению. Этот раствор хранится при температуре 4 – 8 °C и не требует дальнейшего разведения. Если планируется использовать коммерческие антитела, то необходимо внимательно ознакомиться с прилагаемой к ним инструкцией, в которой указаны условия хранения, оптимальные для поддержания активности антител, и следовать ей.

Литература

Альтшулер E. П., Серебряная Д. В., Катруха А. Г. Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности // Усп. биол. химии. – 2010. – Т. 50. – С. 203 – 258.

Кеннет Р. Г., Мак-Керн Т. Дж., Бехтол К. Б. Моноклональные антитела: Гибридомы: новый уровень биологического анализа. – М.: Медицина, 1983.

Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. – М.: Мир, 2000.

Тиллиб С. В. Верблюжьи антитела – эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии // Мол. биол. – 2011. – Т. 1. – С. 77 – 85.

Фримел Г. Иммунологические методы. – М.: Медицина, 1987.

Atassi M. Z. Molecular Immunology. – New York: Marcel Decer, Inc., 1984.

Boenisch T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents // Appl. Immunohistochem. – 2001. – Vol. 9. – P. 176 – 179.

Burton D. R., Gregory L., Jefferis R. Aspects of the molecular structure of IgG subclasses // Monogr. Allergy. – 1986. – Vol. 19. – P. 7 – 35.

Haunghton G., Larry W. A., Whitmore A. B-1 cells are made, not born // Immunology Today. – 1993. – Vol. 14. – P. 84 – 86.

Herschowitz H. I. D. Immunophysiology: Cell function and cellular interactions in antibody formation // Immunology III / Ed. J. A. Bellanti. – Philadelphia: Saunders, 1985.

Глава 3.

СПОСОБЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ И УСИЛЕНИЯ ПРОДУКТА РЕАКЦИИ «АНТИГЕН – АНТИТЕЛО»

Необходимым этапом любого иммуногистохимического метода является визуализация результатов реакции «антиген – антитело». Выявить антитела, связавшиеся с антигеном, можно, используя различные метки, связанные с Fc-фрагментом антител. Такими метками могут быть: флуорохромы, ферменты, металлы и металлопротеины, радиоизотопы, промежуточные связующие вещества, например биотин, дигоксигенин.

Возможно использование меченых антител против интересующего антигена (прямой метод). В этом случае антитела взаимодействуют с антигеном в местах их локализации, последние выявляют при помощи метки, связанной с антителами. Такой метод визуализации наиболее простой, однако его чувствительность крайне низкая, поскольку на одну молекулу искомого антигена будет приходиться одно меченое антитело.

Для повышения чувствительности был разработан непрямой метод детекции с использованием двух различных антител. Первичные антитела реагируют с антигенами ткани. Связанные с меткой вторичные антитела специфически взаимодействуют с первичными, которые для вторичных антител являются антигенами. Метод значительно чувствительнее прямого, так как с каждой молекулой первичных антител связывается несколько молекул вторичных антител, содержащих метку. Хотя добавляется еще один этап, такой метод имеет некоторые преимущества:

– вторичные антитела против Fc-фрагмента другого вида животного получать намного проще, также легче присоединить к ним метку;

– первичные антитела не несут на себе лишнего груза в виде метки, а значит, легче и быстрее проникают в ткани, метка не влияет на конформационные изменения после взаимодействия антител с антигеном.

В качестве меток изначально использовались различные флуорохромы, дающие излучение в видимом диапазоне спектра при облучении их светом с определенной длиной волны, но для их использования требуется наличие флуоресцентного микроскопа с набором барьерных фильтров. Кроме этого, такие препараты нельзя хранить из-за быстрого затухания флуоресценции.

Для того чтобы препараты можно было исследовать с помощью обычной световой микроскопии и долго хранить, были разработаны методы получения стабильных окрасок. Наиболее простой меткой являются металлы, например коллоидное золото. В результате реакции «антиген – антитело» в месте скопления антител в световом микроскопе обнаруживается окрашивание. Допустимо использование радиоизотопов, однако их применяют очень редко из-за высокой опасности облучения персонала. Наибольшее распространение получили ферментные метки, например HRP, AP и глюкозоксидаза. Для каждого указанного фермента существует несколько субстратов, которые под действием фермента образуют нерастворимые красители различных цветов. Необходимо учитывать, что пероксидаза и AP есть и в тканях организма, поэтому иногда можно получить ложноположительные результаты. Пероксидаза содержится в большом количестве в нейтрофилах и эозинофилах, поэтому для окраски мазков крови, костного мозга и срезов иммунокомпетентных органов использование этого фермента не рекомендуется. При окраске других тканей небольшая пероксидазная активность блокируется добавлением перекиси водорода перед инкубацией с первичными антителами. AP содержится во многих тканях, поэтому во время инкубации с субстратом в него добавляют левамизол (ингибитор AP). Необходимо помнить, что AP клеток кишечника и плаценты не ингибируется левамизолом, поэтому для этих тканей лучше использовать другие ферменты. Глюкозоксидаза может использоваться без ограничений, так как в тканях млекопитающих не встречается. Если чувствительности такой системы недостаточно, то дополнительно используют антитела против пероксидазы или AP. Эти антитела связываются с антигенсвязывающим участком вторичных антител, что увеличивает чувствительность метода еще в 2 раза.

Следующий шаг на пути повышения чувствительности метода – иммуноокрашивание с использованием биотинавидинового комплекса. Биотин – это стойкое к действию высоких температур и широкому диапазону рН соединение, которое хорошо растворяется в воде и спирте. Биотин легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами. При использовании биотина немеченые первичные антитела соединяются с антигеном; меченные биотином вторичные антитела соединяются с первичными; добавляется комплекс «авидин – биотин – фермент», который присоединяется к биотину вторичных антител. Данный метод был назван ABC-методом (аббревиатура от английского avidin and biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular сomplex). Авидин может быть заменен на стрептавидин – белок с молекулярной массой около 60 кДа, который получают из микроорганизмов Streptomyces avidinii.

В отличие от авидина стрептавидин не связывается с эндогенными лектин-подобными веществами, что позволяет резко уменьшить фоновое окрашивание и повысить чувствительность метода. Конъюгация стрептавидина непосредственно с маркерным ферментом позволяет увеличить стабильность используемых реактивов и сделать важный шаг на пути стандартизации методов ИГХ-окрашивания препаратов. Используя вторичные антитела, связанные с биотином, и комплекс «стрептавидин – маркерный фермент», можно выявить связавшиеся с детектируемым антигеном первичные антитела в два этапа. В случае, если в качестве вторичных антител используется смесь биотинилированных антител против иммуноглобулинов нескольких животных, такой реактив допустимо использовать при работе с первичными антителами различной видовой принадлежности (например, мышиными и кроличьими). Подобный подход реализован различными биотехнологическими компаниями в удобных наборах, которые широко используются в настоящее время (например, наборы LSAB2 и LSAB+ (Dako) и др.).